石蜡切片免疫组化实验报告
一、实验原理
免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）利用抗原与抗体特异性结合的原理，使用抗体去标记组织细胞内的蛋白质，然后通过化学反应使抗体显色来确定组织细胞内的蛋白质的位置和表达量。
二、实验器材及试剂
2.1实验器材
名称 | 厂家 | 型号 |
脱水机 | 上海徕卡仪器有限公司 | TP1020 |
包埋机 | 上海徕卡仪器有限公司 | HistoCore Arcadia H |
病理切片机 | 上海徕卡仪器有限公司 | HistoCore BIOCUT |
冻台 | 宁波江丰生物 | KF-EMC-100 |
组织摊片机 | 宁波江丰生物 | KF-WS-100 |
烤箱 | 上海慧泰仪器制造有限公司 | DHG-9140A |
载玻片 | 江苏世泰实验器材有限公司 | 188105 |
盖玻片 | 江苏世泰实验器材有限公司 | 10212432C |
微波炉 | 格兰仕微波炉电器有限公司 | P70D20TL-P4 |
脱色摇床 | Servicebio | TSY-B |
移液枪 | Dragon | KE0003087/KA0056573 |
组化笔 | Gene tech | GT1001 |
扫描仪 | 3DHISTECH | Pannoramic MIDI |
2.2 主要实验试剂
试剂 | 厂家 | 货号 |
无水乙醇 | 国药集团化学试剂有限公司 | 100092183 |
二甲苯 | 国药集团化学试剂有限公司 |
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EDTA(PH9.0)抗原修复液 | 阳明医学检验实验室 | YM230002 |
PBS缓冲液 | 阳明医学检验实验室 | YM230010 |
30%双氧水 | 国药集团化学试剂有限公司 | 7722-84-1 |
BSA | 阳明医学检验实验室 | YM230008 |
苏木素染液 | thermofisher |
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苏木素分化液 | thermofisher |
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苏木素返蓝液 | thermofisher |
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中性树胶 | Dako |
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组化试剂盒DAB显色剂 | Dako | K5007 |
抗体 | 货号 | 稀释比 | 二抗 | 货号 | 修复 |
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| HRP标记山羊抗鼠兔通用二抗 |
| EDTA9.0 |
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三、石蜡切片免疫组化实验步骤
1、 石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-二甲苯III 15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-蒸馏水洗。
2、 抗原修复：组织切片置于盛满抗原修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复，中火8min至沸，停火8min保温再转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
3、 阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%双氧水溶液，室温避光孵育25 min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。
4、 血清封闭:在组化圈内滴加3%BSA 均匀覆盖组织，室温封闭30min。
5、 加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加PBS按一定比例配好的一抗，切片平放于湿盒内4°C孵育过夜。（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）
6、 加二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的二抗（HRP标记）覆盖组织，室温孵育50min。
7、 DAB显色：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下控制显色时间，阳性为棕黄色，自来水冲洗切片终止显色。
8、 复染细胞核：苏木素复染3min左右，自来水洗，苏木素分化液分化数秒，自来水冲洗，苏木素返蓝液返蓝，流水冲洗。
9、 脱水封片：将切片依次放入75%酒精5min-85%酒精5min --无水乙醇Ⅰ5min -无水乙醇Ⅱ5min -二甲苯Ⅰ5min 中脱水透明，将切片从二甲苯拿出来稍晾干，中性树胶封片。
10、 显微镜镜检，图像采集分析。
四、石蜡切片免疫组化结果判读
苏木素染细胞核为蓝色，DAB显出的阳性表达为棕黄色
0574-6262-1777