荧光多标实验报告

六色多重荧光染色试剂盒Plus（六标七色）

原理介绍:酪酰胺信号放大(TSA，Tyramidesignalamplification)技术是一类利用辣根过氧化酶（HRP）对靶蛋白进行标记的酶学检测方法，类似常规免疫组化的DAB显色方法，TSA技术同样采用HRP标记的二抗，同样有对应的“显色”步骤（HRP催化加入反应体系的酪胺荧光素底物，产生活化荧光底物，活化底物可与抗原上的酪氨酸等残基共价结合，使样品上稳定的共价结合酪胺荧光素。之后用热修复法或者抗体洗脱液洗去非共价结合的一抗-二抗-HRP复合物，重复下一种一抗-hrp二抗来第二轮孵育，换另一种酪胺荧光素底物，如此往复就可实现多重标记。

TSA详细原理是利用酪胺Tyramide的过氧化物酶反应(酪胺盐在HRP催化H202下形成共价键结合位点)，产生大量的酶促产物，该产物能与周围的蛋白残基(包括色氨酸、组氨酸和酪氨酸残基)结合，这样在抗原-抗体结合部位就有大量的荧光素沉积，结果使其检测信号得到10-100倍增强。简单来说，用这种方法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP（而不是直接偶联荧光素），来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波或煮沸或者水浴等热修复处理，前一轮非共价结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素稳定共价结合在样本切片蛋白上。再换个一抗来第二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵育结束，荧光素都结合好后，最后去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。此试剂盒中的荧光染料可单独或配合使用。可以实现单标、双标、三标以及更多重荧光放大/多重同源抗体荧光标记等功能，极大丰富了此试剂盒的内涵。

试剂盒规格：100T

试剂盒货号：YM0086Plus-67-100T

储存温度：4度，一年有效

试剂盒组成：

染料使用方法：TSA荧光染料反应液=TYR-xxx Plus荧光染料+TSA buffer；TYR-xxx Plus荧光染料：TSA buffer=1：200；TYR-xxx Plus荧光染料与TSA buffer的稀释比例可以根据具体情况灵活调整优化，最佳范围为1:50--1:400(1:200大部分情况能得到最佳结果）；一般建议若一抗孵育时间常温1h-3h内，建议稀释比例1:50-1:200,若一抗孵育时间4度过夜（12h或以上），建议稀释比例1:200-1:400或更高。 

详细操作步骤

1、样本准备：

1）石蜡切片：依次将切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min，蒸馏水洗。

2）冰冻切片：冰冻切片固定10-30min，PBS洗5min，重复3次，滴加0.3%triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次。

3）细胞爬片或者细胞涂片：细胞样本固定10-30min，PBS洗5min重复3次，滴加0.3%triton-X100破

膜液通透20min，PBS洗5min，重复3次。

2、抗原修复：组织切片置于盛满PH9.0EDTA碱性抗原修复液或者PH6.0柠檬酸修复缓冲液的修复盒中于微波炉内进行抗原修复（也可以用高压1-2min100度水煮15min95度水浴20min等其他热修复方法）。中火8min，停火8min，转中低火7min，此过程中应防止缓冲液过度蒸发，切勿干片。自然冷却后将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。(修复液和修复条件根据组织类型以及抗原类型来确定，冰冻切片和细胞样本可省略此步骤）。

3、阻断内源性过氧化物酶：切片放入3%过氧化氢溶液，室温避光孵育15min，将玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。

4、非特异性靶点封闭:切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈（防止抗体流走），在圈内滴加用抗体稀释液（或者其他封闭液3%BSA或者山羊血清）均匀覆盖组织，室温封闭30min。额外说明：抗体稀释液内含有各种保护剂以及防腐剂，可以用来封闭或者稀释一抗，稀释后的一抗可以长期四度保存（在常温下也可以保存一个月之久）

5、加一抗：轻轻甩掉封闭液，在切片上滴加用抗体稀释液稀释好的的一抗X，切片平放于避光湿盒内4°C孵育过夜或者37度1-2h（湿盒内加少量水防止抗体蒸发）；

6、加hrp二抗：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加与一抗相应种属的hrp二抗覆盖组织，避光室温孵育50min，PBS洗三次。额外说明：本试剂盒内自带的hrp山羊抗兔/鼠通用二抗为即用型，具有超高灵敏度，随时可用，无需配置。

7、TSA荧光染料反应液反应：浓缩型荧光染料与TSAbuffer按照1:50-1:200的比例混合均匀，切片滴加配好的TSA荧光染料反应液均匀覆盖组织室温反应1-15min（最佳时间5min-10min），PBS洗三次（预实验可先染1min洗干净荧光染料后显微镜下观察染色效果，如果阳性弱继续滴加荧光染料加强染色强度直至合适强度后继续进行下一步）。

8、抗体洗脱：石蜡切片置于抗原修复液中95度水浴25-40min（根据不同抗体亲和力灵活调整时间）或者滴加适量37度预热至完全溶解的mIHC专用抗体洗脱液（冰冻切片爬片骨组织建议用）覆盖样本，37度放置5-20分钟，弃去洗脱液，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖样本37度放置5-20分钟，弃洗脱液，PBS洗三次，每次5分钟（石蜡切片可用热修复洗脱或者抗体洗脱液洗脱，细胞及冰切切片需用抗体洗脱液进

行洗脱）

9、重复3-8步骤（换用另外一种TYR-XXXPLus荧光染料）---第二轮标记

10、重复3-8步骤（换用另外一种TYR-XXXPLus荧光染料）---第三轮标记

11、重复3-8步骤（换用另外一种TYR-XXXPLus荧光染料）---第四轮标记

12、重复3-8步骤（换用另外一种TYR-XXXPLus荧光染料）---第五轮标记

13、重复3-8步骤（换用另外一种TYR-XXXPLus荧光染料）---第五轮标记

14、DAPI复染细胞核：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI即用型染液，避光室温孵育5min-20min。

15、封片：玻片置于PBS（PH7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。

16、镜检拍照：切片于荧光显微镜/共聚焦/多通道荧光扫描仪/多光谱成像系统下观察并采集图像。