流式检测

服务介绍：

　　活性氧簇ROS是由氧分子还原所形成的分子或者离子，大部分都是由线粒体产生的副产物，它们会在细胞代谢包括细胞内呼吸和底物氧化过程中产生。适量的ROS是细胞必需的，因为ROS参与维持细胞存活及生理功能所需的各种生活过程，如信号转导和基因表达，但过量或过少的ROS都会诱导氧化应激，破坏核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物和细胞膜等，导致细胞死亡和组织破坏。

　　DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞后，被水解生成DCFH。而DCFH不能透过细胞膜。细胞内的ROS可以氧化无荧光的DCFH生成有荧光的DCF。DCF被488nm激发光激发后，发射530nm的荧光信号，被FITC通道接收，检测DCF的荧光就可以判定细胞内活性氧ROS的水平。

      线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1是一种理想的用于检测线粒体膜电位的荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。其原理是，当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，488nm激发时的最大发射波长为590nm，可以产生红色荧光，在流式上表现为FL1和FL2双阳性;当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，488nm激发时最大发射波长为527nm，可以产生绿色荧光，形成流式图汇总所有细胞FL1为阳性。凋亡细胞则大多为FL1单阳性。不同荧光颜色的转变反应线粒体膜电位的变化，常用红绿荧光的相对比例衡量线粒体去极化的比例。

      PI是一种溴化乙啶的类似物，能够与DNA强力结合，它在嵌入双链DNA后释放红色荧光。尽管PI不能通过活细胞膜，但却能穿过破损的细胞膜而对核染色。可根据此原理，采用流式细胞仪对活死细胞进行鉴定及分析。

　　细胞周期(Cell Cycle)是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。间期又分为三期：即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。某些细胞在分裂结束后暂时离开细胞周期，停止细胞分裂，执行一定生物学功能(G0期)。

　　流式细胞仪PI染色法检测细胞周期的原理：由于细胞周期各时相的DNA 含量不同,通常正常细胞的G1/ G0 期具有二倍体细胞的DNA含量(2N) ,而 G2/ M 期具有四倍体细胞的DNA 含量(4N) ,而S期的DNA 含量介于二倍体和四倍体之间。PI(碘化丙啶)为插入性核酸荧光染料，能选择性嵌入核酸DNA和RNA双螺旋的碱基之间与之结合，结合量与DNA的含量成正比关系，其荧光强度直接能反映细胞内DNA含量。因此,通过流式细胞仪PI染色法对细胞内DNA含量进行检测时,可以将细胞周期各时相区分为G1/G0 期,S 期和G2/M 期,获得的流式直方图对应的各细胞周期可通过特殊软件计算各时相的细胞百分率。

细胞及流式检测样本准备方法及要求

1、活细胞运输方法

请用如图所示不透气培养瓶培养细胞，待细胞汇合度达到70%左右时，灌满新鲜培养基至接近瓶口处，拧紧瓶盖，封口膜进一步封住瓶口。瓶身上做好标记（细胞名称，培养基，日期等）。打包时必需做防震处理。

2、冻存细胞运输方法

一定要保证干冰充足，冻存管确保被干冰完全覆盖。切勿冻融。

3、流式样本接收注意事项

3.1细胞凋亡

需要活细胞。如果细胞带荧光，一定要在交接单和培养板上备注，否则按照无荧光处理。如果因此导致检测结果不可用及样本浪费，我方概不负责，也不接受退单。

3.2细胞周期

周期需要细胞量比较多，6孔板送样要求汇合度在70%，但不能超过90%。收集细胞沉淀后加入预冷的70%乙醇固定，封口膜封好管口，4℃运输寄到实验室。

3.3流式JC-1

需要活细胞（外地样本不接）。细胞汇合度高于70%（6孔板），多提供2个空白孔，做阴性和阳性对照。如果细胞带红光或绿光，不能检测。

3.4流式ROS

需要活细胞（外地样本不接）。细胞汇合度高于70%（6孔板），多提供2个空白孔，做阴性和阳性对照。如果细胞带绿光，不能检测。

3.5细胞表抗

提前确定公司是否有相应流式抗体（组化抗体不可用），其他抗体需要客户自己提供（外地样本不接）。

3.6流式三标

提前告知样本具体数量和类型（血液或脾脏~）。血样用抗凝管收集（胞内染色至少需要1.5 ml，表抗需要约1 ml），注意防止凝血，4℃保存运输。血样4℃保存最多只能存放一周，时间越久实验结果越差。取血后，需尽快寄到实验室；取脾脏时尽量将动物带到实验室，直接在实验室取材后开始实验，若不能将动物带到实验室，取材（整个脾脏）后将组织放在含有PBS的EP管或离心管中，4℃保存，提细胞必须在取材后6小时以内完成，注意有些检测指标（Treg,TH1, TH2等）需无菌提取（仅接收武汉样本）。